由于膜蛋白在细胞信号转导和运输中发挥着关键作用,因此具有非常大的潜力成为药物靶点。但是由于它们的低表达量以及提取后难于保持天然构象和低溶解度等特点,使得其结构及功能表征,以及最终开发出针对性治疗药物非常具有挑战性。一起来了解下 NanoTemper 是如何助力如 G 蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道蛋白和转运蛋白等膜蛋白研究的。

了解 NanoTemper 工具如何帮助您应对膜蛋白研究中的挑战

 

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筛选使结构更加稳定的条件

在膜蛋白药物设计中,结构表征是非常重要的步骤之一。为此,研究人员首先需要从天然生物膜中提取足够量的蛋白,然后在不同的去垢剂和脂质环境中筛选出确保蛋白正确折叠及稳定的最适条件。这里我们列举两个案例,分别介绍 NanoTemper 技术在快速筛选去垢剂和黏性添加剂中的应用。

 


 

快速找到稳定膜蛋白的去垢剂条件

膜蛋白的结构及功能表征首先需要用去垢剂从天然的膜环境中提取蛋白。但是找到既可以确保蛋白稳定性又能够满足溶解度的去垢剂非常困难。在这项研究中,研究人员使用了免标记的 nanoDSF 技术快速筛选了 9 种膜蛋白在 94 种不同去垢剂中的热稳定性。然后使用那些可以保持蛋白稳定性的去垢剂进行后续的蛋白纯化和结构研究。

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结晶前对高粘稠添加剂的筛选

膜蛋白非常难结晶,一方面受其溶解度限制,另一方面在膜环境外维持其天然构象非常困难。in meso结晶使用脂质立方相 (LCP, lipid cubic phase) 提供类膜环境从而使膜蛋白结晶。同缓冲液与去垢剂筛选一样,此案例中对不同类型的 LCP 和添加剂进行了筛选。研究小组使用 nanoDSF 技术快速筛选了不同的 LCP (其中包括非常粘稠的LCP环境)。

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进行快速的、免标记缓冲液及化合物的 GPCRs 筛选

 

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研究极具挑战性的膜蛋白相互作用,从而改善药物设计

 

要想了解膜蛋白在细胞过程中扮演的角色,就需要了解它与配体的相互作用。这些信息可以帮助我们更好地了解和设计针对这些细胞过程的药物。在药物开发过程中,实现在溶液条件中免标记的相互作用检测可以有效地帮助研发人员阐明药物作用的分子机制,进而改善药物设计。

 


 

改善靶向膜蛋白的药物设计

人源 PepT1 转运子在药物摄取和传输中起着重要的作用,被认为是极具潜力的药物靶点。利用 DtpA (细菌同源蛋白),研究团队使用免标记的 MST 技术分别检测了多肽和药物与 DtpA 的结合。这些数据帮助他们为人体转运蛋白建模,并改进相关药物设计。此外,他们还使用免标记 nanoDSF 技术研究了纳米体是如何提高转运蛋白结构和结晶稳定性的。

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在溶液环境中识别关键结合位点

NRT1.1 质子偶联转运蛋白负责植物体内氮的同化和硝酸盐的转运。在自然界中,它通过磷酸化过程,在与硝酸盐强结合和弱结合的状态之间切换,以响应硝酸盐水平的下降。为了了解这一机制,研究人员使用 MST 技术研究了在去垢剂中磷酸化和点突变对 GFP 融合 NRT1.1 和硝酸盐结合的影响。结合晶体学数据,他们发现了一个参与转运蛋白与硝酸盐结合的关键氨基酸残基,并揭示了磷酸化是如何改变转运蛋白结合状态的。

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使用Nanodiscs (纳米磷脂盘) 和 SMALPs 在天然条件下对样品进行表征

为了表征膜蛋白,研究人员首先需要将它们从天然脂质环境中提取出来,但是这个过程可能从根本上改变它们的结构,影响其功能。使用 Nanodiscs 和 SMALPs 研究膜蛋白可以确保其处于一个类膜环境中,在这种环境中可以使用 nanoDSF 和 MST 来研究膜蛋白的结构和功能,因为这两种方法是允许在溶液环境中直接进行检测的,这相比于需要将样品固定在基质表面的方法来说具有很大的优势。

 


 

研究脂质纳米颗粒中的膜蛋白

使用去垢剂将膜蛋白从其天然脂质环境中提取出来常常会引起重要脂质的结构和功能的丧失。纳米磷脂盘提供了一种在非常接近天然条件下检测膜蛋白的方法。在这项研究中,研究人员使用 nanoDSF 技术发现,相比去垢剂,将膜蛋白重组到saposin脂质纳米颗粒中可以提高其稳定性。免标记的 Label-free MST 技术进而证实了脂质纳米颗粒中的膜蛋白和其配体的结合符合预期,表明它们在类膜环境中保持了正确的结构和功能。

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发现膜组分如何影响 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 结合活性

在体内,G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 的信号活性受其周围质膜脂质组成的影响。GPCRs 作为重要的药物靶标,我们需要了解脂质组成如何影响它们与药物的结合与互作。此项研究中,研究人员使用 MST 技术研究了溶液中带有一个 GPCR 的血清素及其受体在不同脂质组分纳米磷脂盘中的相互作用。他们发现,血清素与其受体的结合亲和力由于纳米磷脂盘的脂质组分而有所不同。

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Study interactions of low expressing GPCRs in native membranes

人类多巴胺受体是一种 G蛋白偶联受体 (GPCR),是治疗各种神经和精神疾病的关键药物靶点。该受体在人工实验条件下的表达量非常低,很难进行其结构和功能的研究。该团队成功地通过不含去垢剂的脂质纳米盘 (接近自然的膜环境) 将人 GPCR 从天然脂质环境中提取出来。他们使用MST技术首次证明了神经紧张素与人类多巴胺受体在其自然状态下的结合。

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